2.2 UV-VIS
法測定靈芝孢子粉中靈芝多醣的含量
[5-8]
2.2.1
測定波長的選擇
精密量取標準品儲備液
2mL
,
置
25mL
容量瓶中,
加水
至刻度,搖勻後,精密量取
2mL
,置具塞試管中,精密加入硫酸
-
蒽酮溶液
(
精密量取
蒽酮
0.1g
,加入
80%
的硫酸溶液
100mL
中,使溶解,搖勻
)6mL
,搖勻,置沸水浴
中加熱
15min
,
取出,
放入冰浴中冷卻
15min
,
取出。
同時以蒸餾水
2mL
平行操作,
作為空白,在
400
~
800nm
範圍內對標準品溶液進行波長掃描。結果在波長
625nm
處有最大吸收,如圖
3
,因此實驗測定波長為
625nm
。
圖
3
葡萄糖標準品的
UV
圖譜
2.2.2
標準品儲備液的製備
精密稱取
105
℃乾燥至恆重的無水葡萄糖
0.0744g
,
置
100mL
容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻即得。
2.2.3
樣品溶液的製備
取靈芝孢子粉約
0.6g
,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密
加水
90mL
,加熱回流
3h
,放冷,搖勻,離心,提取液轉移至
100mL
容量瓶中,加
水稀釋至刻度,搖勻,精密量取
10mL
,加入乙醇
150mL
,搖勻,
4
℃放置
12h
,取
出,離心,傾去上清液,沉澱加水溶解並轉移至
25mL
容量瓶中,加水稀釋至刻度,
搖勻,即得樣品溶液。
2.2.4
標準曲線
精密量取標準品儲備液
0
、
1
、
2.5
、
3.5
、
4
、
8mL
,分別置
50mL
容量瓶中,加水至刻度,搖勻。精密量取上述各溶液
2mL
,置具塞試管中,精
密加入硫酸
-
蒽酮溶液
6mL
,
置沸水浴中加熱
15min
,
取出,
放入冰浴中冷卻
15min
,
以第一管為空白,在
625nm
波長處測定吸光度,以標準品濃度
X(μg/m
L)
為橫坐標,
吸光度值為縱坐標,繪製標準曲線。經計算得回歸方程為
Y=0.0091X
,
r=0.9991
,
對方程檢驗,
F=148.902
,
P<0.01
,
有統計學意義。
結果表明,
在
14.9
~
119.1μg/mL
的範圍內,
葡萄糖標準品溶液濃度與吸光度線性關係良好。
標準品的
UV
圖譜見圖
4A
。
圖
4
靈芝多醣
UV
譜圖
A-
葡萄糖標準品
B-
樣品
2.2.5
精密度試驗
精密量取標準品儲備液
2mL
,
置
25mL
容量瓶中,
加水至刻
度,搖勻後精密量取
2mL
,
按照
“2.3.2”
項下方法顯色,
在
625nm
處測定吸光度,連
續測定
5
次,吸光度平均值為
0.5654
,
RSD
為
0.24%
,表明方法精密度良好。
2.2.6
穩定性試驗
精密量取標準品儲備液
2mL
,
置
25mL
容量瓶中,
加水至刻
度,搖勻後精密量取
2mL
,照
“2.3.2”
項下方法顯色,每隔
0
、
5
、
10min
、
20
、
30
、
40
、
60
分鐘測定標準品溶液在
625nm
處的吸光度值,至第
30
分鐘時,
5
次測量結
果吸光度平均值為
0.5575(n=5)
,
RSD
為
0.72%
,結果表明,顯色在
30min
之內
穩定。
2.2.7
回收率試驗
取靈芝孢子粉樣品
5
份,
每份約
1g
,
精密稱定後分別加入一
定量的葡萄糖標準品,按照
“2.3.3”
項下方法進行製備,在
625nm
處測定吸光度併計
算加樣回收率,結果見表
3
。
2.2.8
樣品測定
將樣品溶液照
“2.3.2”
項下的方法顯色,
在
625nm
處測定吸光
度併計算含量,結果見表
4
,樣品
UV
圖譜見圖
4B
。
表
3
加樣回收率測定結果(
%
,
n
=5
,
±
s
)
Tab. 3 Recoveries of polysaccharides constituents
(
%
,
n
=5
,
±
s
)
批號
取
樣量
(
g
)
樣品中
靈芝多醣含
量(
mg
)
添加葡萄
糖標準品含量
(
mg
)
實測靈
芝多醣含量
(
mg
)
回
收率
(
%
)
±
s
R
SD
(
%
)
2005040
7
1.17
13.48
10.57
24.63
1
02.4
1
01.4
±
3.1
3
.14
1.08
12.44
10.57
22.71
9
8.7
0.89
10.25
10.57
21.6
1
1
03.8
1
.21
13.9
4
10.57
25.5
1
1
04.1
1
.14
13.1
3
10.57
23.1
3
9
7.6
表
4
含量測定結果
(
%
,
n
=5
,
±
s
)
Tab. 4 Contents of samples
(
%
,
n
=5
,
±
s
))
3
討論
對靈芝三萜類成分的含量測定採用
HPLC
法。
用
HPLC
法測定了靈芝孢子粉中靈芝
酸
C2
的含量,標準品其純度經
HPLC
檢查,大於
98%
,符合標準品的要求。選擇流
動相時,
甲醇與水的配比對樣品的分離影響較大,
結果表明甲醇比水
55
∶
45
的配比在
本實驗條件下較為合適。
加入
1%
的冰醋酸的目的是為了減少峰的脫尾。
另外在樣品提
取處理時,對超聲、回流時間進行了考察,比較了超聲
15min
及
30min
,回流
1h
、
4h
、
9h
的提取效果。測定結果表明超聲
30min
、回流
4h
已將樣品提取完全,並且雜
質較少,從而確定提取時間。
對靈芝孢子粉中的靈芝多醣採用
UV-VIS
法進行含量測定。
影響多醣含量測定的因
素很多,
各種顯色方法測定的結果也不同,
2005
版藥典中使用的蒽酮
-
硫酸比色法同苯
酚
-
硫酸法、
地衣酚比色法相比,
顯色試劑配製簡便快捷,
方法簡單可靠,
顯色穩定性、
重現性好,
因此實驗中選用該方法。
但測定過程中冷卻、
加熱時間與氧化還原作用有關,
因此要準確控制時間。在待測溶液中加入硫酸
-
蒽酮溶液後要充分振盪混勻,置沸水浴
中加熱時間也需嚴格控制,以免影響測定結果。
法測定靈芝孢子粉中靈芝多醣的含量
[5-8]
2.2.1
測定波長的選擇
精密量取標準品儲備液
2mL
,
置
25mL
容量瓶中,
加水
至刻度,搖勻後,精密量取
2mL
,置具塞試管中,精密加入硫酸
-
蒽酮溶液
(
精密量取
蒽酮
0.1g
,加入
80%
的硫酸溶液
100mL
中,使溶解,搖勻
)6mL
,搖勻,置沸水浴
中加熱
15min
,
取出,
放入冰浴中冷卻
15min
,
取出。
同時以蒸餾水
2mL
平行操作,
作為空白,在
400
~
800nm
範圍內對標準品溶液進行波長掃描。結果在波長
625nm
處有最大吸收,如圖
3
,因此實驗測定波長為
625nm
。
圖
3
葡萄糖標準品的
UV
圖譜
2.2.2
標準品儲備液的製備
精密稱取
105
℃乾燥至恆重的無水葡萄糖
0.0744g
,
置
100mL
容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻即得。
2.2.3
樣品溶液的製備
取靈芝孢子粉約
0.6g
,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密
加水
90mL
,加熱回流
3h
,放冷,搖勻,離心,提取液轉移至
100mL
容量瓶中,加
水稀釋至刻度,搖勻,精密量取
10mL
,加入乙醇
150mL
,搖勻,
4
℃放置
12h
,取
出,離心,傾去上清液,沉澱加水溶解並轉移至
25mL
容量瓶中,加水稀釋至刻度,
搖勻,即得樣品溶液。
2.2.4
標準曲線
精密量取標準品儲備液
0
、
1
、
2.5
、
3.5
、
4
、
8mL
,分別置
50mL
容量瓶中,加水至刻度,搖勻。精密量取上述各溶液
2mL
,置具塞試管中,精
密加入硫酸
-
蒽酮溶液
6mL
,
置沸水浴中加熱
15min
,
取出,
放入冰浴中冷卻
15min
,
以第一管為空白,在
625nm
波長處測定吸光度,以標準品濃度
X(μg/m
L)
為橫坐標,
吸光度值為縱坐標,繪製標準曲線。經計算得回歸方程為
Y=0.0091X
,
r=0.9991
,
對方程檢驗,
F=148.902
,
P<0.01
,
有統計學意義。
結果表明,
在
14.9
~
119.1μg/mL
的範圍內,
葡萄糖標準品溶液濃度與吸光度線性關係良好。
標準品的
UV
圖譜見圖
4A
。
圖
4
靈芝多醣
UV
譜圖
A-
葡萄糖標準品
B-
樣品
2.2.5
精密度試驗
精密量取標準品儲備液
2mL
,
置
25mL
容量瓶中,
加水至刻
度,搖勻後精密量取
2mL
,
按照
“2.3.2”
項下方法顯色,
在
625nm
處測定吸光度,連
續測定
5
次,吸光度平均值為
0.5654
,
RSD
為
0.24%
,表明方法精密度良好。
2.2.6
穩定性試驗
精密量取標準品儲備液
2mL
,
置
25mL
容量瓶中,
加水至刻
度,搖勻後精密量取
2mL
,照
“2.3.2”
項下方法顯色,每隔
0
、
5
、
10min
、
20
、
30
、
40
、
60
分鐘測定標準品溶液在
625nm
處的吸光度值,至第
30
分鐘時,
5
次測量結
果吸光度平均值為
0.5575(n=5)
,
RSD
為
0.72%
,結果表明,顯色在
30min
之內
穩定。
2.2.7
回收率試驗
取靈芝孢子粉樣品
5
份,
每份約
1g
,
精密稱定後分別加入一
定量的葡萄糖標準品,按照
“2.3.3”
項下方法進行製備,在
625nm
處測定吸光度併計
算加樣回收率,結果見表
3
。
2.2.8
樣品測定
將樣品溶液照
“2.3.2”
項下的方法顯色,
在
625nm
處測定吸光
度併計算含量,結果見表
4
,樣品
UV
圖譜見圖
4B
。
表
3
加樣回收率測定結果(
%
,
n
=5
,
±
s
)
Tab. 3 Recoveries of polysaccharides constituents
(
%
,
n
=5
,
±
s
)
批號
取
樣量
(
g
)
樣品中
靈芝多醣含
量(
mg
)
添加葡萄
糖標準品含量
(
mg
)
實測靈
芝多醣含量
(
mg
)
回
收率
(
%
)
±
s
R
SD
(
%
)
2005040
7
1.17
13.48
10.57
24.63
1
02.4
1
01.4
±
3.1
3
.14
1.08
12.44
10.57
22.71
9
8.7
0.89
10.25
10.57
21.6
1
1
03.8
1
.21
13.9
4
10.57
25.5
1
1
04.1
1
.14
13.1
3
10.57
23.1
3
9
7.6
表
4
含量測定結果
(
%
,
n
=5
,
±
s
)
Tab. 4 Contents of samples
(
%
,
n
=5
,
±
s
))
3
討論
對靈芝三萜類成分的含量測定採用
HPLC
法。
用
HPLC
法測定了靈芝孢子粉中靈芝
酸
C2
的含量,標準品其純度經
HPLC
檢查,大於
98%
,符合標準品的要求。選擇流
動相時,
甲醇與水的配比對樣品的分離影響較大,
結果表明甲醇比水
55
∶
45
的配比在
本實驗條件下較為合適。
加入
1%
的冰醋酸的目的是為了減少峰的脫尾。
另外在樣品提
取處理時,對超聲、回流時間進行了考察,比較了超聲
15min
及
30min
,回流
1h
、
4h
、
9h
的提取效果。測定結果表明超聲
30min
、回流
4h
已將樣品提取完全,並且雜
質較少,從而確定提取時間。
對靈芝孢子粉中的靈芝多醣採用
UV-VIS
法進行含量測定。
影響多醣含量測定的因
素很多,
各種顯色方法測定的結果也不同,
2005
版藥典中使用的蒽酮
-
硫酸比色法同苯
酚
-
硫酸法、
地衣酚比色法相比,
顯色試劑配製簡便快捷,
方法簡單可靠,
顯色穩定性、
重現性好,
因此實驗中選用該方法。
但測定過程中冷卻、
加熱時間與氧化還原作用有關,
因此要準確控制時間。在待測溶液中加入硫酸
-
蒽酮溶液後要充分振盪混勻,置沸水浴
中加熱時間也需嚴格控制,以免影響測定結果。
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