2013年9月7日 星期六

萌動激活赤靈芝孢子粉對腫瘤組織端粒酶活性抑製作用的研究

萌動激活赤靈芝孢子粉對腫瘤組織端粒酶活性抑製作用的研究陳小君,馮翠萍2 ,劉昕2 (1. 中山醫科大學腫瘤防治中心腫瘤研究所,廣東廣州510060;2. 中山大學生命科學學院,廣東廣州510275) 中圖分類號:R282.71 文獻標識碼:A 文章編號:0253 - 2670(2001)S0– 0135 - 02 靈芝孢子(The spores from Ganoderma lucidum Karst)是靈芝發育週期中的另一形態,即靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的象淡霧狀的極其微小的孢子,具有靈芝的全部遺傳活性物質。近年來對靈芝的研究極為廣泛[1~5]。有許多研究表明靈芝及靈芝孢子粉對各種腫瘤有明顯的抑製作用[2~4 ,6~7] 。但對其抑瘤作用的機制研究較少,本文首次研究了靈芝孢子粉對端粒酶活性的影響並探討其對抑瘤作用機制。 1 材料與方法1.1 材料:試驗用NIH小鼠,由廣東省衛生廳實驗動物中心提供。鼠重20~22 g,雌雄各半。小鼠肝癌(Hepatoma)由本所提供。萌動激活赤靈芝孢子粉口服液(0.2 g/mL)由中山大學國家教育部食品工程研究中心及廣州綠色盈康生物工程有限公司提供。端粒酶PCR-ELISA試劑盒和蛋白Assay ESL試劑盒均由BOEHRINGER MANNHEIM 公司提供。 1.2 腫瘤組織的獲取:無菌條件下抽取腹腔保種7 d生長良好的腹水型小鼠肝癌細胞用生理鹽水以1:1稀釋後,將腫瘤細胞懸液接種於小鼠的右腋皮下,每隻小鼠均接種0.2 mL。接種後的小鼠均隨機分成4組,每組10只。陰性對照組:注射用生理鹽水每天20 mL/kg;靈芝孢子粉低、中、 高劑量組:每天2,4,8 g/kg。各組小鼠均於接種瘤株後24h開始ig給藥,連續用藥10 d。觀察各組小鼠的活動狀況、皮毛光澤度及糞便性狀。於最後一次給藥後次日處死小鼠,剝離腫瘤組織,稱瘤重併計算抑瘤率。無菌條件下取約0.2 g腫瘤組織,20℃保存用於檢測端粒酶活性。 1.3 標本提取液的製備:取標本約0.2 g,放於1.5 mL尖底離心管中,用已消毒的眼科剪刀,反复剪碎組織呈糊狀。加入裂解液150 L,充分混勻。置4 ℃冰箱1~2 h。離心 (4℃,15 000 r/min) 25 min。吸取上清液,放入0.5 mL管中,20 ℃保存待用。標本提取物蛋白蛋濃度的測定:在1.5 mL的比色杯中加入100 L的試劑A;將標本提取液各50 L加入相應的比色杯中,混勻。室溫孵育5 min~1 h。在第一個比色杯中加1000 L試劑B,簡單的混勻,30 s後立即測定其485 nm波長的吸光度(A)值。以裂解液做為空白對照。以所測得的A值​​在校準曲線上計算相應的蛋白濃度。以10 g為擬定標準蛋白量,計算所需標本提取液的量。標本提取液的PCR擴增:25 L擴增液,加標本提取液5 L(2 g/L) 後加無菌水至50 L,覆蓋石蠟油。 PCR擴增( 25 ℃、30 min,94 ℃、5 min,1個循環;94 ℃、30 s,50 ℃、30 s,72 ℃、90 s,30個循環;72 ℃、10 min,4 ℃保存。) 雜交及ELISA:PCR產物5L+變性液20L→室溫10min,加雜交液225L混勻,每孔取100L→包被板中→​​室溫,避光2h,用洗滌液洗3~5次,拍幹,加入酶工作液100L,室溫,避光30min,用洗滌液洗3~5次,拍幹,TMB底物100L,室溫,避光30min,終止液100L,30min內酶標儀比色。結果判定​​:在450 nm波長調整空白並以450及690 nm波長測樣本孔A值。標本:450  690 = A波長>0.2 = 陽性2 結果2.1 靈芝孢子粉對小鼠肝癌有明顯的抑製作用,低、中、高劑量組的抑瘤率分別為52.2%、62.7%及73.2%。各實驗組瘤重與對照組瘤重比較,經t檢驗結果有統計學意義(表1)。表1 靈芝孢子粉對小鼠移植性腫瘤小鼠肝癌的作用組別劑量(g/kg·d) 動物數始/末體重(g) 瘤重(g) (x±s) 抑瘤率 (%) 始 末 變化  對照組— 10/10 21.88±1.17 34.73±4.99 +12.9 2.34±0.60 —  靈芝孢子粉2 10/10 22.07±1.03 30.54±3.38 +8.47 0.74±0.20 62.8* 靈芝孢子粉4 10/10 21.87±1.03 31.16±3.07 +9.92 0.62±0.10 73.5* 靈芝孢子粉8 10/10 21.90±0.90 30.94±2.38 +9.00 0.44±0.21 81.0* *            與對照組比:*P<0.01 * * P<0.001 收稿日期:2000-10-25 作者簡介:陳小君女,中山醫科在學腫瘤研究所教授,研究生導師。 1960年畢業於中山醫學院,繼續攻讀生物化學研究生,留校後從事抗癌藥物的藥理、腫瘤化療及腫瘤分子生物學的研究,發表論文多篇,曾獲國家教委、廣東省衛生廳、高教廳科技進步獎,並參加《現代醫學進展》的編寫及《維生素,營養與癌》的主譯者之一。   資料彙編    54 ·136· 《中草藥》Chinese Traditional and Herbal Drugs 2001年第32卷增刊2.2 靈芝孢子粉對小鼠肝癌組織端粒酶活性的抑製作用:對照組陽性標本9例,陰性1例;靈芝孢子粉低劑量組陽性3例,陰性7例;靈芝孢子粉中、高劑量組陽性均為1例,陰性均為9例。以上結果經Fisher精確概率檢驗,各劑量組分別與對照組比較P<0.01,差異性有統計學意義(表2)。表2 萌動激活靈芝孢子粉對小鼠肝癌組織端粒酶活性的影響組別劑量(g/kg·d) 波長 450 nm ~ 690 nm 陽性(例) 陰性(例 ) 對照組 — 9 1 靈芝孢子粉* 2 3 7 靈芝孢子粉* 4 1 9 靈芝孢子粉* 8 1 9 與對照組比:* P<0.01 3 討論已有資料證明[8~9] ,端粒酶的活性與腫瘤的類型有關, 即在良性腫瘤中無活性而在惡性腫瘤中有活性,提示端粒酶參與了腫瘤的形成過程,它的激活給細胞提供了無限生長繁殖的可能,推動了腫瘤的形成、擴展以至轉移的過程。由於端粒酶存在於大部分的腫瘤細胞中,正常組織(除生殖細胞外)都測不到端粒酶活性,因此,尋找端粒酶的抑製劑可望成為腫瘤治療領域的又一新的理想目標。如果抑製劑能特異地抑制腫瘤細胞的端粒酶活性,那麼隨著瘤細胞的分裂,端粒會越來越短,瘤細胞就會一步步走向死亡,以達到限制腫瘤細胞無限增殖,使腫瘤停止生長甚至自動消退的目的。上述結果表明,靈芝孢子粉對小鼠肝癌有明顯的抑製作用,同時表明靈芝孢子粉低、中、高劑量組對小鼠肝癌組織中的端粒酶活性有明顯的抑製作用,因而,靈芝孢子粉的抑瘤作用的機制可能與其對端粒酶活性抑制有關。本實驗為靈芝孢子粉作為一種端粒酶活性的抑製劑應用於惡性腫瘤臨床治療的可能性提供有意義的依據。

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